Validación de resultados en el laboratorio de Bioquímica Clínica

Escrito por José M. Rivera Pérez Viernes, 04 de Septiembre de 2009 01:17

Edición 1 - Farmacia

José M. Rivera Pérez
Profesor de Bioquímica
Facultad de Farmacia
Universidad de Iberoamérica

Alumnos que participaron en los análisis/ Carolina Acuña Cruz/ Yadira Chávez Corrales/ Rebeca Flores Piña/ Diego A. García Vargas/ Andrea M. Guevara Zúñiga/ Ana Rebeca Hidalgo Fernández/ Erick R. Núñez Castro/ David Orozco Bonilla/ María A. Quesada Lacayo/ Olivia Rodríguez Quesada/ Greivin G. Rodríguez Ramírez/ Johanna Rodríguez Salas/ Rosmy Ruiz Vázquez/ Kattia P. Serrano Alvarado/ Estefannie A. Solano Meza/ Sandy Wen Tang/ Jackeline J. Alfaro Perera/ Karla V. Alfaro Solano/ Enard A. Alvarado Carranza/ María F. Arce Herrera/ Wendy Y. Castillo Suárez/ Katiana de los A. Esquivel Arce/ Minor Esquivel Campos/ Jessica Lara Murillo/ Luis D. Montero Sánchez/ Víctor M. Morales Gutiérrez/ Silvia P. Pérez Bolaños/ Alejandro A. Ramírez Romero/ Juan C. Salas Bravo/ Luis C. Tencio Araya

Resumen

Se establece una evaluación de resultados de bioquímica clínica realizada con  sueros controles, en cuatro parámetros metabólicos, por estudiantes del curso de Bioquímica de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Iberoamérica, durante el tercer cuatrimestre del 2008. Estos sueros de origen humano se adquirieron en la Empresa Inmunolab Costa Rica, que provee soporte en áreas de la investigación biomédica; y los reactivos enzimáticos proceden de  Ticolab S.A. de Costa Rica.

El trabajo plantea una estimación estadística del grado de confiabilidad de los resultados  obtenidos por un personal no adiestrado, tomando como referencia la calidad de los sueros controles y la robustez de las técnicas analíticas empleadas.  Se  realizaron quince determinaciones en cada uno de los analitos seleccionados: glucosa, colesterol, ácido úrico y triglicéridos; empleando suero humano liofilizado, normal y anormal. En este último,  los niveles de los metabolitos están incrementados.

Se hicieron comparaciones  estadísticas de las medias experimentales con valores de referencia certificados para cada una de las variables del suero, con el fin de  detectar la presencia de errores sistemáticos en las determinaciones; en esas comparaciones se utilizaron los criterios de desviación estándar observada (DEO) y desviación relativa porcentual (DRP),  que se emplean en el  control  de calidad interno y externo de   laboratorios clínicos.

Los parámetros de control reflejaron resultados satisfactorios en glucosa, ácido úrico y colesterol, no así en triglicéridos; donde las concentraciones determinadas por los estudiantes no cumplen con los criterios de exactitud requeridos.

La mayoría de los análisis realizados se emplearon en las comparaciones estadísticas, después de descartar los resultados que se apartaron de la tendencia central. Se  pudo establecer la calidad de los controles y la robustez de las técnicas sugeridas por los proveedores, ya que de los cuatro analitos determinados, tres arrojaron resultados aceptables a pesar de que fueron realizados por  estudiantes.

Las mediciones de los volúmenes con micropipetas manuales, y la calibración y manejo del espectrofotómetro por los alumnos, resultan aspectos críticos en este tipo de determinación.

Palabras claves

Validación de métodos analíticos, robustez, desviación estándar observada, desviación relativa porcentual, control positivo, control negativo

Abstract

An evaluation of results of clinical biochemistry made with serum settles down controls, in four metabolic parameters, by students del course of Biochemistry, of the Faculty of Pharmacy of the University of Ibero-America, during the third fourth month period del 2008. These serums of human origin were acquired in the Company Inmunolab Costa Rica, that provides support in areas with the biomedical investigation; and the enzymatic reagents come from Ticolab S.A. of Costa Rica.

The work raises a statistical estimation degree of trustworthiness of the results obtained by inexpert personnel, taking like reference the quality from serums controls and the robustness from the used analytical techniques. Fifteen determinations were made in each one of the selected product: glucose, cholesterol, uric acid and triglycerides, using lyophilized human serum, normal and abnormal; in this last one, the levels of the chemicals are increased.
.
Statistical comparisons became of the experimental averages with values of reference certified for each one of the variables del serum, with the aim to detect the presence of bias in the determinations; in those comparisons the criteria of standard deviation observed (DEO) and percentage relative deviation were used (DRP), that are used in control of the internal and external quality of clinical laboratories.

The control parameters reflected satisfactory results in glucose, uric acid and cholesterol, not thus in triglycerides; where the concentrations determined by the students do not fulfill the required criteria of exactitude.

The majority of the made analyses was used in the statistical comparisons, later to discard the results that separated from the central tendency. And it was possible to be established the quality of the controls, and the robustness of the techniques suggested by the suppliers; since of the four determined chemicals, three threw acceptable results; although they were made by students.

The measurements of the volumes with manual micropipettes and the calibration and handling of the spectrophotometer by the students are critical aspects in this type from determination.

Key Words

Validation of analytical methods, robustness, observed standard deviation, percentage relative deviation, positive control, negative control

Introducción

La validación de los métodos analíticos contempla un conjunto de procedimientos que tienen como objetivo establecer las fuentes de variabilidad y el error sistemático que pueden afectar los resultados analíticos del método. Además, en los métodos validados se establece el grado de especificidad y el nivel de detección sobre un analito en particular, así como la capacidad de respuesta del método ante pequeñas variaciones en las cantidades de la especie investigada. Un aspecto importante en los parámetros analíticos de un método lo constituye su robustez, definida como “la  medida de la capacidad de un procedimiento analítico de permanecer inafectado por pequeñas pero deliberadas variaciones en los parámetros del método y proveer una indicación de su fiabilidad en condiciones de uso normales”. (1)

En las pruebas estadísticas es posible cometer dos tipos de errores  cuando se trata de establecer si los resultados analíticos no son significativamente diferentes a un nivel de confianza determinado. El error de tipo I se comete cuando se rechaza la hipótesis de que dos resultados son equivalentes, cuando en realidad resultan estadísticamente iguales; y el error de tipo II cuando se aceptan como iguales, cuando en realidad no son estadísticamente equivalentes (2)

Un aspecto crítico en bioquímica clínica lo constituye el conocimiento cabal del margen de error asociado a los resultados analíticos, lo cual permite establecer el grado de confiabilidad de los mismos, que será utilizado para establecer el estado de salud o enfermedad de los pacientes. A tales efectos,  los laboratorios certificados deben contar con un programa de evaluación externa de la calidad que les permita comparar los resultados de sus análisis con los de otros laboratorios afines; e instrumentar   un control interno efectivo  de esa calidad. (3).

Una premisa para la implantación de estos sistemas de calidad es la utilización de sueros  controles multivariables certificados, que se acompañan de un reporte de valores medios y de rangos de variabilidad esperados (4);  así como del empleo de técnicas confiables respaldadas  por el amplio uso en análisis clínico (5). En los análisis seriados de las muestras de suero de pacientes se intercalan los sueros controles, (cuyos resultados certificados están estimados de antemano) y se utilizan para valorar la confiabilidad de los análisis de las muestras de pacientes, en términos de exactitud; lo cual que es una medida de tendencia central y de precisión que se refiere a la variabilidad. (6)

La calibración de estos métodos, que permite relacionar la respuesta analítica con la concentración del metabolito,  se establece mediante normas químicas por comparación con estándares externos, que se preparan por separado de la muestra. En estas determinaciones se considera un comportamiento lineal en el parámetro instrumental del analito que se cuantifica, para cierto intervalo de concentraciones,  lo que permite hacer lecturas con un control negativo y un control positivo (7).

El control negativo permite establecer que la metodología es específica para el analito, pues en ausencia de éste no se detecta la propiedad medible; en este caso, la absorbancia de radiación visible por un grupo cromógeno que se desarrolla. Y el control positivo, de concentración conocida, nos permite comprobar la funcionalidad del método, con la obtención de un color específico, cuya intensidad se relaciona de forma directa con la concentración del analito; o sea, el control positivo se utiliza para comprobar qué tan exacta fue la calibración.

En  los análisis se emplearon controles negativos y positivos, y como muestra el suero control normal Ser-T-Fy I, y el anormal o alterado Ser-T-Fy II, de Stanbio Laboratory;  que cuentan con una certificación de valores medios, desviación estándar e intervalos de confianza de la media. (8)

En este trabajo se realiza una evaluación en términos de exactitud y precisión de las concentraciones obtenidas en glucosa, colesterol, triglicéridos y ácido  úrico, empleando los referidos sueros. De la comparación estadística se pretende establecer el grado de destreza que pueden alcanzar los alumnos en un laboratorio docente en el manejo de técnicas de química clínica, que normalmente son realizadas por laboratorios certificados, que cuentan con estrictos controles de calidad y personal  entrenado.

Materiales y métodos

Se utilizó un espectrofotómetro Cary Win UV/VISIBLE de VARIAN para las medidas de absorbancia, con cubeta de cuarzo de 1 cm de paso óptico. Los reactivos se dispensaron con micropipetas monocanales certificadas (9), de volumen variable de 5 a 50 µl y de 10 a 100 µl. Para lograr el llenado de las cubetas se incrementaron, de forma proporcional,  los volúmenes de reactivos estipulados en las técnicas.
Los viales de los sueros se reconstituyeron con 5 ml de agua desionizada y despirogenizada obtenida mediante  un equipo de ósmosis inversa con lámpara UV. La incubación de las muestras se desarrolló en un baño termostatizado a 37 °C, durante 5 min.

Las determinaciones de los metabolitos en suero se efectuaron  con los métodos analíticos que se describen a continuación:

1. Glucosa (GOD/POD): la glucosa se convierte en gluconato por la glucosa oxidasa con producción de peróxido de hidrógeno, reacción que se acopla a la peroxidada,  oxidando la 4-aminofenazona que se acopla a un derivado fenólico formando un cromógeno que absorbe a 500 nm. La intensidad del color es proporcional a la concentración de glucosa en suero. (10)
2. Triglicéridos: se hidroliza el triglicérido por acción de una lipasa y el glicerol liberado se fosforila por una gliceroquinasa, convirtiéndose en glicerol-3-fosfato que se oxida liberando peróxido de hidrógeno, el cual oxida una amina aromática propiciando su unión con un derivado fenólico; formando el cromógeno del tipo quinonaimina,  que absorbe a 500 nm. La absorbancia del complejo coloreado es proporcional a la cantidad de triglicérido en el suero. (11)
3. Ácido úrico (Uricasa): la determinación involucra el acoplamiento de reacciones enzimáticas. La uricasa convierte el ácido úrico en alantoína y peróxido de hidrógeno, una peroxidada impulsa la oxidación con peróxido de la 4-aminofenazona y el acoplamiento con un derivado fenólico para producir el cromógeno que absorbe a 520 nm. (12)
4. Colesterol total (Colesterol esterasa):  la colesterol esterasa hidroliza los ésteres de colesterol y el colesterol liberado es convertido en colesten-3-ona y peróxido de hidrógeno por la colesterol oxidasa;  una peroxidada utiliza la acción oxidante del peróxido para la formación del cromógeno entre la 4-aminofenazona y un derivado fenólico, que absorbe a 500 nm. (13)

La intensidad del color que desarrollan los cromógenos en estas técnicas se mide en términos de absorbancia y se relacionan con la concentración del analito, de acuerdo con   la ley de Lambert Beer.

Estas determinaciones involucran una serie de reacciones enzimáticas acopladas, que en alguna etapa del proceso generan peróxido de hidrógeno, el cual es el sustrato aceptor de electrones de una enzima vegetal, la peroxidada de rábano picante (Horseradish peroxidasa o HRP). Esta enzima cataliza la oxidación de la 4-aminofenazona (4-AAP) y un derivado fenólico, por el H2O2, lo que da lugar a la formación de un cromógeno tipo quinonaimina; esta reacción se conoce  como sistema indicador de Trinder.

Figura # 1

Se efectuaron  quince determinaciones en cada uno de los cuatro analitos seleccionados y se descartaron los valores atípicos o discordantes que no aplicaron  a los  intervalos de confianza que generan los errores aleatorios del procedimiento. Estos intervalos de confianza se certifican en los controles. (14)

En el descarte de  determinaciones clínicas, con métodos manuales y automatizados, se tienen en cuenta no solo la variabilidad estadística, sino también la complejidad de las matrices que se analizan; en este caso  suero no hemolizado.

En términos estadísticos se presume que los valores atípicos son el resultado de errores brutos o crasos no detectados durante el desarrollo del análisis. Con los resultados aceptados se determinó la media, como medida de tendencia central,  que se comparó con la media de referencia certificada para los sueros controles. Esta confrontación se hizo aplicando la siguiente expresión. (15)

La DEO aporta una medida de la diferencia entre las medias que se comparan con relación a un valor que se asume como el 5% del valor de la media de referencia, en éste caso DEE. Esta desviación estándar observada establece un criterio de aceptación de la media experimental cuando es menor o igual a ± 2.

El otro criterio que se considera para establecer la calidad de las determinaciones al confrontarla con el valor medio de referencia  se expresa mediante: (16)

El DRP es una medida de cuánto se aleja el valor obtenido en el laboratorio con relación a la media de referencia, que se considera el valor real aceptable, expresada en porcentaje.

Se considera que un valor del desvío relativo promedio menor o igual a ±10 % es criterio de aceptación de validez de los resultados que se logran en el laboratorio, empleando métodos manuales; en comparación con los controles positivos que expresan valores de consenso reales.

Estos criterios tienen en cuenta parámetros estadísticos y variabilidad biológica, de acuerdo con la naturaleza de las muestras que se manejan en química clínica. En particular el comportamiento del DRP en periodos de tiempo de seis meses se describe con una función matemática denominada Sistema de Puntaje F, cuyos valores de cero a infinito se utilizan para evaluar el comportamiento de los resultados históricos en un laboratorio clínico. (17)

Resultados y discusión

En la tabla 1 se muestran los resultados obtenidos al confrontar la media experimental de los valores obtenidos por los alumnos, con los valores de consenso, que en este caso son los certificados en los sueros controles. En la misma se han utilizado los criterios referidos anteriormente, los cuales se emplean en redes de laboratorios que implementan programas de controles de calidad externos e internos.

Como se puede observar en las determinaciones de  glucosa en suero no patológico y en los análisis de colesterol y ácido úrico, empleando sueros patológicos certificados, los resultados  se pueden considerar como válidos, ya que los valores de DEO y de DRP están contemplados en los intervalos establecidos, que son iguales o menores a ± 2  y a ± 10 %, respectivamente.

En el caso de las determinaciones de triglicéridos, además de presentar la mayor cantidad de datos descartados, tampoco cumplieron con los valores establecidos para los criterios de DEO y DRP, por lo cual en  este caso los análisis realizados no fueron válidos.

En la tabla 2 se considera del total de determinaciones realizadas, las que se descartaron por arrojar resultados discordantes con los intervalos esperados que establecen los sueros controles. Esos valores anómalos reflejan errores groseros en las determinaciones; aunque como se puede observar el 80% del total de todas las determinaciones se aceptaron.

En el caso de las determinaciones de triglicéridos, además de presentar la mayor cantidad de datos descartados, tampoco cumplió con los valores establecidos para los criterios de DEO y DRP; por lo que para este metabolito los análisis realizados no fueron válidos.

El criterio empleado para descartar resultados experimentales consistió  en rechazar todos los datos que aplicaron fuera del rango de aceptación o consenso que se establece en la certificación de los controles. Estos rangos aparecen en la tabla 3; en estos controles los rangos de aceptación se determinan mediante el valor medio más menos tres veces la desviación estándar. A su vez, la desviación estándar de los controles constituye entre el 6,6% y el 6,8 % del valor nominal de la media, según el analito que se considere.

Tabla 1. Resultados de los análisis en suero control

Tabla 2. Total de determinaciones y valores rechazados

Tabla 3. Intervalos de confianza o consenso certificados en los controles

Conclusiones

Tomando en consideración los resultados de los análisis realizados se pueden establecer las siguientes conclusiones:

1. De las sesenta determinaciones realizadas por los estudiantes se rechazaron  doce  que no aplicaron al rango de consenso de los controles.
2. El descarte de valores de las determinaciones  por tipo de analito se comportó de la forma siguiente: se descartaron 13,3 % de los resultados de  glucosa y 26,6 % de triglicérido,  en suero normal;  y 20% de colesterol y 20% de ácido úrico,  en suero patológico.
3. En las determinaciones que no fueron descartadas: el 86,7% de las determinaciones de glucosa así como el 80% en el caso del colesterol y del ácido úrico, se pudo determinar que cumplen con la calidad requerida en este tipo de análisis;  por cuanto sus desviaciones estándares observadas (DEO < ± 2) y las desviaciones relativas porcentuales (DRP < ± 10), no sobrepasan los límites de aceptación de calidad, para métodos manuales, en  laboratorios clínicos.
4. En el caso de las determinaciones de triglicéridos, donde el 73,4 % no fueron descartadas, cuando se aplicaron los criterios de DEO y de DRP cayeron fuera del rango establecido; por lo que este tipo de análisis estuvo permeado de errores sistemáticos por parte de los alumnos.
5. Tomando en consideración la falta de adiestramiento previo para la realización de este tipo de ensayo, el hecho de que una mayoría significativa de los resultados analizados para tres de los cuatro  analitos se acepte, constituye una evidencia de  que se trabajó con una calidad analítica aceptable.

Referencias bibliográficas

1.    Costa Rica, Leyes y Reglamentos. Reglamento de Validación de Métodos Analíticos Requeridos para el Registro Sanitario de Medicamentos ante el Ministerio de Salud. Disponible en : http://www.ministeriodesalud.go.cr/reglamentos/29968.doc
2.    Skoog, Douglas A., et al. Fundamentos de química analítica. Octava edición. Thompsom, 2005 .p. 144.
3.    Mazziotta D. Programa de evaluación externa de calidad. Disponible en http://www.fba.org.ar/peec/00-peec.html (consultado: febrero, 2009)
4.    Stanbio Laboratory. Página web Disponible en http://www.stanbio.com (consultado: diciembre, 2008)
5.    Laboratorios Ticolab. Página web  (consultado: octubre, 2008)
6.    Rodríguez, N. ¿Informamos resultados confiables en los laboratorios clínicos? XV Jornadas Científicas de la Sociedad Venezolana de Bioanalistas Especialistas. Memorias, pp. 55-59, 2005
7.    Skoog, Douglas A., et al. Principios de análisis instrumental. Sexta edición. Cengage Learning Editores,  2008 .pp. 11-17.
8.    Stanbio Laboratory. Página web Disponible en http://www.stanbio.com (consultado: febrero, 2009)
9.    Manual de instrucciones del productor.
10.    Trinder, P. Determination of blood glucose using 4-amino phenazone as oxygen acceptor: J. Clin. Path. 22, 246, (1969).
11.    Tietz, N. W. Fundamentals of Clinical Chemistry. 2nd ed. W. B. Saunders Co. Philadelphia, 1982.
12.    Ibidem.
13.    Gordon,T. et al. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease Amer. J. Med. 62, 707, 1977
14.    Stanbio Laboratory. Página web Disponible en http://www.stanbio.com (consultado: febrero, 2009)
15.    Dharán, M. (1983). Control de calidad en los laboratorios clínicos. Editorial Reverté  S.A., Barcelona, España, 1983.
16.    Mazziotta, D. Análisis de los parámetros de aceptabilidad en química clínica y Puntaje F. Programa de Evaluación Externa de la Calidad. Fundación Bioquímica Argentina, 2005.
17.    Perasso, Eduardo y Daniel Mazotta. “Evaluación de métodos por la Evaluación   Externa de Calidad en Química Analítica.” Acta Bioquím. Clin. Latinoam. V. 38 no. 1. La Plata, enero/marzo, 2004.